萤火虫在进行生物发光时需要有D―萤光素、萤光素酶、腺苷三磷酸（回ATP）、两价镁离子（Mg2+）和氧等物质答存在。但是，天然萤光素的对映体，即L萤光素却不发光。这种发光反应中的化学变化，可以通过其它化学发光物质，以及萤光素的模拟化合物的发光机理来类推。现在认为它是按照下面的方式来发光的。
反应的第一步是萤光素在Mg2+的存在下，受萤光素酶的作用，与ATP反应，生成萤光素腺耷酸和焦磷酸。接着，萤光素腺苷酸进一步在萤光素酶的作用下，与分子氧反应，生成氢过氧化物阴离子，这种阴离子即按照发光反应第一步的途径，生成含有萤光素腺昔酸和焦磷油的二氧四环的化合物，由于这种化合物是一种能量很高的不稳定的化合物，所以它很快分解，放出二氧化碳，生成一种羰基化合物。这时羰基化合物是处于一种激发状态中。通过模拟实验的结果表明，它直接发出来的光是红光，而实际上萤火虫发出来的光之所以是黄绿色，乃是由羰基化合物再脱掉一个质子后生成的阴离子所发的光。