教堂于1481年完工后，波提切利等文艺复兴初期画家以耶稣基督为主题创作了一批壁画。版1483年，在此举行权过西克斯图斯四世的圣体告别。
最初的西斯廷教堂的穹顶绘有天空图案的壁画。1506年，教皇儒略二世（又称朱理二世）为了纪念叔父西克斯图斯四世，命米开朗基罗重新绘制穹顶壁画。米开朗基罗独自一人于1508年开始设计创作此壁画，并命名为《创世纪》，壁画于1512年最终完成。此幅穹顶画描绘了旧约中创世纪的9个场景。场面宏大，气势恢宏，人物众多。而西斯廷教堂也正因拥有了米开朗基罗最有最有代表性的两大巨制壁画《创世纪》和《最后的审判》而闻名于天下。